基础化学实验3.分析检测与表征_石志红，魏海英，张红医　著_9787122251350

　　《基础化学实验3分析检测与表征》第2版是***实验教学示范中心基础化学实验系列教材中的一个分册。将化学分析实验与现代仪器分析实验整合到一起，使学生对分析化学实验有较为全面的认识。在保持**版基本格局的前提下，主要修订内容如下：重新审定了全部实验，修正了**版中的不妥之处；仪器设备更新换代之后，相应的仪器操作步骤和实验内容均作了调整；大部分章节增加了新的实验项目；色谱和质谱联用技术在补充了新的实验项目的基础上单独设立了一章；增加了第13章即计算机软件在分析化学实验中的应用；增设了附录以便于读者查找相关数据。
　　《基础化学实验3分析检测与表征》第2版可作为高等学校化学、化工、应化、材化、高分子材料与工程、药学、生命科学、环境科学、环境工程、食品、农林、师范院校等相关专业学生化学分析和仪器分析实验课程的教材，也可作为高校教师及实验技术人员的参考书。

　　实验10-16 高效液相色谱法测定食品中苏丹红

　　一、预习要点
　　1. 固相萃取样品预处理方法的原理和操作要点；
　　2. 梯度洗脱的特点。
　　二、实验目的
　　1. 了解梯度洗脱的特点和梯度洗脱条件的设定方法；
　　2. 学习固相萃取样品预处理方法；
　　3. 学习高效液相色谱测定食品中的苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的原理和实验方法。
　　三、实验原理
　　苏丹红为人工合成的一类偶氮类工业染料，主要应用于溶剂、蜡染、增光等方面，由于其成本低廉，颜色鲜艳，不易褪色，不少不法商贩将苏丹红添加到鸡鸭饲料以及辣椒制品等食品中去，极大地危害了消费者的健康。研究表明，苏丹红的原型和代谢产物均有潜在致癌作用，已被禁止作为食品添加剂使用。目前已报道食品中苏丹红的检测方法有液相色谱法、液质联用法、气质联用法等。
　　本实验采用高效液相色谱法测定食品中苏丹红的含量。样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱-紫外可见光检测器进行检测，梯度洗脱，采用外标法定量。
　　四、仪器与试剂
　　1.仪器
　　高效液相色谱仪（配有紫外可见分光光度检测器）；分析天平：感量0.1 mg；旋转蒸发仪；均质机；离心机；0.45 μm有机滤膜；层析柱管：1 cm（内径）×5 cm(高)的注射器管。
　　2．试剂
　　乙腈、丙酮，均为色谱纯；甲酸、乙醚、正己烷、无水硫酸钠，均为分析纯。
　　层析用氧化铝（中性，100~200目）：105 ℃干燥2 h，于干燥器中冷至室温，每100 g中加入2 mL水，混匀后密封，放置12 h后使用。
　　5%丙酮的正己烷液：吸取50 mL丙酮，用正己烷定容至1 L；标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红III、苏丹红IV，纯度≥95%；标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红III及苏丹红IV各10.0 mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后，用正己烷定容至250 mL。
　　五、实验步骤
　　1．氧化铝层析柱的制备：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3 cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10 mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。
　　2．样品处理
　　（1）红辣椒粉等粉状样品
　　称取1~5 g红辣椒粉（准确至0.001 g）于锥形瓶中，加入10~30 mL正己烷，超声5 min，过滤，用10 mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5 mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2 mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干固涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5 cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少，用10~30 mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤后待测。
　　（2）辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品
　　称取10~20 g（准确至0.01 g）样品于离心管中，加10~20 mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30 mL正己烷：丙酮=3：1，匀浆5 min，3000 rmin-1离心10 min，吸出正己烷层，于下层再加入20 mL×2次正己烷，匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5.0 g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5 min，用5 mL正己烷溶解残渣后，按(1)中“慢慢加入氧化铝层析柱过滤后待测”操作。
　　（3）香肠等肉制品
　　称取粉碎样品10~20 g（准确至0.01 g）于锥形瓶中，加入60 mL正己烷充分匀浆5 min，滤出清液，再以20 mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5 g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5 mL以下，按步骤（1）中“慢慢加入氧化铝层析柱中…过滤后待测”操作。
　　3. 检测
　　（1）配制标准溶液
　　用移液管分别吸取苏丹红标准贮备液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL，用正己烷定容至25 mL，此标准系列浓度为0.00 μgmL-1、0.16 μgmL-1、0.32 μgmL-1、0.64 μgmL-1、1.28 μgmL-1、2.56 μgmL-1。
　　（2）在教师的指导下开启液相色谱仪，设定操作条件。色谱柱：Zorbax SB-C18 (150×4.6 mm i.d., 3. 5 μm)；流动相：溶剂A，0.1%甲酸的水溶液：乙腈=85：15（体积比）;溶剂B， 0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20（体积比）；梯度洗脱条件见表10-1；流速：1 mLmin-1；柱温：30 ℃；检测波长：苏丹红Ⅰ478 nm；苏丹红Ⅱ、苏丹红III、苏丹红IV 520 nm，于苏丹红Ⅰ出峰后切换。进样量10 μL。
　　表10-1 梯度洗脱条件
　　时间/ min 流动相/% 曲线
　　A B
　　0 25 75 线形
　　10.0 25 75 线形
　　25.0 0 100 线形
　　32.0 0 100 线形
　　35.0 25 75 线形
　　40.0 25 75 线形

　　（3）待仪器稳定后，按标准溶液浓度递增的顺序，由稀到浓依次等体积进样10 μL（每个标样重复进样3次），准确记录各自的保留时间。
　　（4）同样取10 μL待测样品进行色谱分析。
　　（5）根据标准物的保留时间确定样品中的苏丹红组分峰。
　　（6）计算系列标准物和样品的峰面积。
　　（7）以标准物的峰面积对相应浓度做工作曲线。
　　（8）从工作曲线上求得样品中苏丹红的浓度。
　　六、数据处理
　　按如下公式（10-3）计算苏丹红含量
　　R = C V M （10-3）
　　式中 R—样品中苏丹红含量， mgkg-1；
　　C—由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度， μgmL-1；
　　V—样液定容体积， mL；
　　M—样品质量， g。
　　七．注意事项
　　1. 不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1 μgmL-1 的苏丹红的混合标准溶液1mL 加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60 mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红III，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低，则表明氧化铝活性偏低；苏丹红III的回收率偏低，则表明氧化铝活性偏高。
　　2. 用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。
　　3. 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10-30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相和初始流动相达到完全平衡。
　　八、思考题
　　1. 如何提高分析的精确度？等度洗脱和梯度洗脱有何区别？
　　2. 梯度洗脱时应注意哪些问题？
　　九、参考文献
　　[1] 中华人民共和国国家标准GBT 19681—2005.食品中苏丹红染料的检测方法.高效液相色谱法.
　　[2] 孙姝琦,田毅敏,杜振霞.超高效液相色谱串联四极杆质谱联用分析番茄酱中苏丹红Ⅰ-Ⅳ含量.分析测试学报, 2007,(26 ) :225.
　　[3] 严拯宇主编.分析化学实验与指导, **版, 中国医药科技出版社 2005：189.
　　[4] 潘志明,李忠,王冰,周路明.食品中苏丹红检测研究进展.世界科技研究与发展, 2007,29(6 ):14.
　　[5] 武汉大学化学与分子科学学院实验中心编. **版. 仪器分析实验.2005: 86-87.

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