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精编免疫学实验指南 读者对象:免疫学、医学基础研究工作者以及临床实验工作者
全书共15章,分别介绍了多克隆抗体和单克隆抗体的制备、纯化和鉴定,人和小鼠T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞等及其亚群的分离、鉴定和各种功能分析,T细胞、B细胞克隆和T细胞杂交瘤的构建,细胞因子及其受体和分泌细胞因子细胞的检测等。
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本实验指南是《现代免疫学方法》(Current Protocolsin Immunology,CPD的精华版。本指南详细完整地介绍了CPI中的主要技术和方法。本书的对象是免疫学研究人员和已学过免疫学理论的本科生和研究生,本书对其他相关科研工作者也有很好的参考价值。
尽管掌握了本书的技术有利于读者用免疫学方法设计和完成实验,但本书并不能代替免疫学的高级培训计划,也不能代替免疫学教科书。此外,为了了解免疫学的术语和概念,读者应当在管理规范化的免疫学实验室中学习,以获得基本技术和安全方面的培训。
本实验指南的框架
本指南以章计。各章中有单元,每个单元介绍一种方法并包括一个以上完整的操作方案(附有材料、操作步骤和参考文献)。本指南的框架与CPI相同,虽然各章中的单元排列与CPI略有不同,但单元的题目是相同的。
本指南中许多试剂和方法是共用的。为了避免操作方案过度复杂和重复,本指南采用各单元和方案间的相互引用。附录2和附录3介绍了一些处理动物和细胞的常用技术。如果读者需要了解相关技术,可参考CPI或其他方法学书籍。
实验方案
本指南的各单元中常有多组方案,每个方案又有一系列步骤。各单元中首先列出基本方案,基本方案是总体介绍或应用最广泛的技术。备选方案用不同的设备或试剂达到同样的实验结果,由于所选材料不同,方法也与基本方案有所差异。辅助方案介绍的是执行基本方案或备选方案所需要的其他步骤,这些步骤分开描述是因为它们可能被本指南的其他部分引用,或它们的操作过程独立于基本方案和备选方案。
试剂和溶液
每一个方案所需试剂和溶液都列在步骤的前面,包括共用的储存溶液、常用的缓冲液和培养基以及各方案需要的特殊溶液。附录1列出所有溶液的配方。需要特别注意的是,在不同单元中,一些溶液的名称相同(如溶解缓冲液),但配方不同。因此,必须用相应的配方制备所需的试剂。为避免混淆,在附录1中,每一个试剂的名称后面都有附加说明列出使用该配方的单元。但常用溶液和缓冲液(如TE缓冲液)没有附加说明。
注:在本指南的所有方案和附录中,均必须用去离子双蒸水配制各种试剂和溶液。需要无菌操作的方案会特别注明。
设备
在每个方案的材料中,均列有该方案所需的特殊设备和器材。本指南虽未列出各方案所需的全部物品,但列出了实验室不常用的、特殊规格的或需要特别准备的设备和器材。实验室所需的常用设备列于后表,这些设备广泛应用于本指南。
产品供应商
本指南介绍了化学试剂、生物试剂和设备的产品供应商。某些注明的品牌已证明是质量或者是市场上仅有的商品,或者是该方案的作者指定在方案中使用的品牌。后一种情况有助于新手在实验中应用。有经验的研究者也可以用他们熟悉的晶牌做同样的实验。
参考文献
本指南仅在每个单元的最后列出该单元最基本的参考文献。如果读者想了解本指南中各方法的背景和应用,可参考CPI。
目录
译者序 前言 第一章 免疫应答导论 1 单元1.1 酶联免疫吸附试验1 基本方案 间接ELISA 法检测特异性抗体 2 备选方案1 直接竞争ELISA 法检测可溶性抗原 4 备选方案2 抗体夹心ELISA 法检测可溶性抗原 5 备选方案3 双抗体夹心ELISA 法检测特异性抗体 7 备选方案4 夹心ELISA 法检测同种型 9 备选方案5 直接细胞ELISA 法检测细胞表面抗原 9 备选方案6 间接细胞ELISA 法检测抗细胞表面抗原的特异性抗体 11 辅助方案 十字交叉连续稀释分析法(criss-cross serial-dilution analysis) 测定试荆最适浓度 12 单元1.2 多克隆抗血清的制备 14 基本方案 使用弗氏佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法 15 备选方案 使用其他佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法 四 辅助方案 从血液中制备血清 17 单元1.3 单克隆抗体的制备 18 基本方案1 单克隆抗体制备中的免疫接种 19 基本方案2 细胞融合与杂交瘤分选 20 辅助方案1 杂交瘤培养上清的筛选分析 23 辅助方案2 杂交瘤的建系 23 辅助方案3 有限稀释克隆法 24 辅助方案4 克隆和扩增用培养基的制备 25 单元1.4 单克隆抗体培养上清与腹水的制备 26 基本方案1 单克隆细胞培养上清的制备 27 备选方案1 单克隆细胞培养上清的大规模制备 27 备选方案2 杂交瘤或细胞系细胞的大规模制备 27 基本方案2 吉有单克隆抗体的腹水制备 28 单元1.5 免疫球蛋白G (IgG) 的纯化 29 基本方案1 硫酸镀沉淀和凝胶过滤层析 29 基本方案2 蛋白A 交联琼脂糖凝胶亲和层析 31 各选方案1 蛋白G 交联琼脂糖凝胶亲和层析 32 备选方案2 抗大鼠k链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶亲和层析 33 单元1.6 免疫球蛋白G (lgG) 片段的水解 34 基本方案1 木瓜蛋白酶水解19G 成Fab 片段摸索性试验 34 基本方案2 木瓜蛋白酶水解19G 获取Fab 片段的大量制备 35 基本方案3 胃蛋白酶水解19G 成F (ab')2 片段的摸索性试验 36 基本方案4 胃蛋白酶水解IgG 获取F (ab)2 片段的大量制备 37 备选方案 用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG 制备F (ab)2 38 单元1.7 免疫球蛋白M (lgM) 和免疫球蛋白D (IgD)的纯化 39 基本方案1 用透析和凝胶过滤层析法纯化IgM 39 各选方案1 硫酸镀沉淀法纯化IgM 39 备选方案2 甘露聚糖结合蛋白亲和纯化IgM 40 备选方案3 IgM 纯化试剂盒 41 基本方案2 凝集素亲和层析法纯化小鼠IgD 41 单元1.8 抗体可变区(V 区)的克隆、表达和修饰 42 基本方案1 通过使用冗余引物克隆和表达免疫球蛋白可变区 43 辅助方案 TA 载体的制备 48 基本方案2 用ELlSA 法鉴定转染细胞分泌的抗体分子 49 基本方案3 转染细胞分泌抗体分子的鉴定 50 单元1.9 核酸免疫 52 基本方案1 小鼠注射接种DNA 53 基本方案2 小鼠基因枪接种DNA 55 辅助方案1 包裹DNA 的金粉颗粒的制备 56 辅助方案2 制备包裹有DNA 的金粉颗粒的样品管 57 辅助方案3 基因枪接种中氯气压力和颗粒大小的最优化 59 第二章 小鼠淋巴细胞功能的体内体外分析 61 单元2.1 小鼠单个核细胞的分离 63 基本方案 从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液 63 辅助方案l 去除脾脏细胞悬液中的虹细胞 63 辅助方案2 一步梯度法去除死细胞 64 单元2.2 磁珠法分离T细胞和B 细胞 64 基本方案1 用AUTOMACS 系统进行总T细胞、CD4+ 细胞或CD8 +T细胞的自动分离 64 基本方案2 使用AUTOMACS 系统进行B 细胞的自动分选 65 基本方案3 使用AUTOMACS 系统进行辅助细胞的自动分选 66 备选方案1 用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞 66 基本方案4 用AUTOMACS 系统自动分选CD4+CD2 5+ 抑制性细胞 67 备选方案2 用磁性分选柱手工操作分离CD4+CD2 5+ 抑制性细胞 68 单元2.3 树突细胞的分离 69 基本方案1 塑料就附和EA 玫瑰花结富集DC 70 辅助方案 胶原酶消化制备脾脏细胞悬液 72 基本方案2 用小鼠骨髓前体细胞培养树突细胞(DC) 73 单元2.4 从小鼠脾脏分离小鼠夭然杀伤细胞 75 基本方案 75 单元2.5 B细胞功能的检测 77 基本方案1 抗原特异性的抗体产生 77 基本方案2 Jerne-Nordin PFC 测定法 81 基本方案3 Cunningham-Szenberg PFC 测定法 83 备选方案1 改良Jerne-Nordin PFC 测克法用于型特异性反应 85 备选方案2 改良Jerne-Nordin PFC 测定法用于测定多克隆抗体反应 85 辅助方案1 制备琼脂糖包被的玻片 85 辅助方案2 制备Cunningham-Szenberg 小室 86 辅助方案3 三硝基苯半抗原(TN的偶联SRBC 86 辅助方案4 蛋白质A 偶联SRBC 87 辅助方案5 制备TNp.卵白蛋白 88 辅助方案6 用Percoll 梯度离心纯化静息B 细胞 88 单元2.6 B 淋巴细胞活化的早期事件四 基本方案1 BCR 诱导的B 细胞内钙变化 90 基本方案2 蛋白质酷氨酸磷酸化的分析 91 基本方案3 细胞太小与B 细胞活化分子表达的分析 92 单元2.7 B 细胞功能的增殖检测方法 93 基本方案 抗19M 与LPS 剌激的B 细胞增殖 93 备选方案1 用8疏基哇琳ω-MG) 剌激B 细胞多克隆活化 94 备选方案2 用蛋白激酶C 激活剂及钙离子载体剌激B 细胞多克隆活化 95 备选方案3 疏酸葡襄糖与poly (1, C) 剌激B 细胞多克隆活化 95 备选方案4 细胞数量增加的定量 95 单元2.8 BrdU 检测T细胞和B 细胞增殖 96 基本方案 96 单元2.9 采用细胞内荧光染料CFSE 检测淋巴细胞的迁移和增殖 97 基本方案 淋巴细胞的CFSE 标记 97 辅助方案 流式细胞仪分析CFSE 标记的细胞 99 单元2.10 细胞毒性T淋巴细胞的诱导及检测 101 基本方案1 从CTL 前体中诱导细胞毒性 101 基本方案2 锵释放法分析CTL 活性 103 辅助方案1 次要组织相容性抗原的小鼠体内应答 105 辅助方案2 病毒抗原体内免疫小鼠 105 辅助方案3 TNP 修饰靶/剌激细胞 106 辅助方案4 病毒感染靶/剌激细胞 106 备选方案1 多克隆CTL 活性的诱导 106 备选方案2 CTL 再宠向杀伤活性的检测 107 单元2.11 T淋巴细胞增殖实验 107 基本方案1 未致敏T淋巴细胞的活化 107 备选方案1 用抗体激活未致敏的T细胞 109 备选方案2 混合淋巴细胞增殖实验 110 辅助方案1 从抗原呈递细胞或剌激细胞悬液中剔除T淋巴细胞 110 辅助方案2 辅助/剌激细胞的灭活 111 基本方案2 致敏T细胞的活化 112 基本方案3 CD4+CD25+T细胞的活化和抑制功能的检测 113 备选方案3 CD4+CD2 5+T细胞抑制功能的两步法检测z 短期活化和扩增CD4 +CD25+T细胞并分析其抑制功能 114 单元2.12 T细胞克隆的建立 115 基本方案1 产生和维持同种反应性Th 和CTL 克隆 115 基本方案2 用可溶性蛋白抗原诱导Th 克隆 116 辅助方案1 制备刀豆蛋白A 活化的上清(Con A 上清) 118 辅助方案2 制备混合淋巴细胞培养上清(MLC 上清) 118 辅助方案3 制备PMA 激活的EL.4 淋巴瘤细胞上清(EL-4 上清) 119 辅助方案4 用显微操作的方法克隆 119 单元2.13 制备小鼠T细胞杂交瘤 120 基本方案 细胞融合和T细胞杂交瘤的选择 120 辅助方案1 筛选表达CD3-TCR 原始杂交瘤 123 辅助方案2 筛选抗原特异性的杂交瘤 124 单元2.14 检测凋亡和其他形式的细胞死亡 125 基本方案1 用活细胞或荧光染料定量细胞活性 125 基本方案2 DNA 裂解片段的定量 126 备选方案 计数放射性标记的DNA 定量细胞中DNA 片段 127 辅助方案1 用125 1 UdR 和51Cr 放射性标记细胞核 127 辅助方案2 用H TdR放射性标记细胞核 128 第三章 细胞活化的生物化学 129 单元3.1 淋巴细胞活化过程中肌醇磷脂周转的分析 130 基本方案1 通过道威克斯(OOWEX) 离子交换层析分析肌醇磷酸 130 备选方案 通过HPLC 方法分析肌醇磷酸 131 基本方案2 通过薄层层析方法分析肌醇磷脂 132 单元3.2 抗磷酸化酷氨酸的印迹检测 133 基本方案 抗磷酸化酶氨酸印迹检测的准备及分析 133 备选方案 使用125 1 标记蛋白A 进行检测 135 单元3.3 免疫复合物方法检测酶氨酸蛋白激酶 135 基本方案 酶氨酸蛋白激酶的免疫沉淀和自身磷酸化检测 136 各选方案1 蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测 138 备选方案2 蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测 138 单元3.4 识别特异性酶氨酸磷酸化多肤抗体的制备 139 基本方案1 多克隆抗磷酸肤抗体的制备 139 基本方案2 制备抗磷酸肤的单克隆抗体 141 辅助方案1 肤的合成 144 辅助方案2 肤段偶联到Affi.Gel10 亲和性基质 144 辅助方案3 磷酸酷氨酸偶联到Affi-Gel10 亲和基质 145 单元3.5 T细胞中丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK) 活性分析 146 基本方案1 免疫复合物蛋白激酶测定" 146 基本方案2 固相蛋白激酶法检测JNK 活性 147 基本方案3 SDS-PAGE 后原位检测JNK 蛋白激酶活性激酶测定 149 基本方案4 利用磷酸化位点特异性抗体检测MAPK 的活化 150 辅助方案 制备GST-MAPK 底物融合蛋白 151 单元3.6 脂役的分离和应用 153 基本方案 通过藤糖梯度浮选法制备去市剂抗性的膜并通过免疫印迹对蛋白质进行分析 153 备选方案 用离心法制备去污剂抗性的膜 156 辅助方案1 脉冲追踪方法分析去湾剂抗性的膜蛋白 157 辅助方案2 通过放射性标记检测去污剂抗性的膜蛋白的全部组分 157 辅助方案3 定量高效薄层色谱法CHP-TLCl进行DRM 脂质分析 158 辅助方案4 DEAE 葡聚糖凝脏的制备 161 辅助方案5 C18 反相色谱柱的制备 162 辅助方案6 用甲基R 环式糊精去除胆固醇来破坏脂缆 163 辅助方案7 甲基#环式糊精(MBCDl处理去除胆固酶的动力学测定 163 辅助方案8 使用MBCD-胆固障复合物进行细胞胆固醇去除 164 第四章 免疲荧光和细胞分离 166 单元4.1 细胞和l 备和试剂 166 基本方案1 单细胞表面抗原的免疫荧光标记 166 基本方案2 固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记 167 辅助方案1 用异硫氨酸荧光黄FITCl 偶联抗体 169 辅助方案2 长臂生物素偶联抗体 170 备选方案1 未固定细胞胞内抗原的免疫荧光检测 170 备选方案2 用7 氨基放线菌素标记死细胞 171 单元4.2 流式细胞仪分析技术BD 公司出品的流式细胞仪 172 基本方案 FITC 偶联抗体的单色分析 173 辅助方案1 用校准微球和FACSComp 软件进行仪器检测 175 辅助方案2 单色分析区分活细胞和死细胞 176 各选方案1 FITC 和PE 偶联抗体的双色分析 177 辅助方案3 双色分析区分活细胞和死细胞 177 备选方案2 三色分析 178 备选方案3 四色分析 178 第五章 细胞因子及其受体 181 单元5.1 IL-2 和IL-4 的检测 183 基本方案 采用CTLL-2 细胞检测小鼠IL-2 和IL-4 183 备选方案1 采用CTLL-2 细胞检测人IL-2 186 备选方案2 采用CT.4S 细胞检测小鼠IL-4 186 备选方案3 采用CT.h4 S 细胞检测人IL-4 187 辅助方案1 自细胞介素或T细胞生长因子(TCGF) 单位的计算 187 辅助方案2 小鼠CTLL-2 细胞的维持 188 辅助方案3 小鼠CT.4S 细胞的维持 189 辅助方案4 小鼠CT.h4 S 细胞的维持 189 单元5.2 IL-10 的检测 190 基本方案 190 单元5.3 江山的检测 191 基本方案 人和小鼠IL-12 p75异二聚体的ELlSA 检测方法 192 备选方案 人和小鼠IL-12亚基的ELlSA 检测 193 单元5.4 IL-13 的检测 193 基本方案 193 单元5.5 IL-15 的检测 194 基本方案 194 单元5.6 IL-18 的检测 196 基本方案 196 单元5.7 y干扰素的检测 197 基本方案 197 单元5.8 流式细胞仪检测细胞内因子 199 基本方案 细胞内因子的荧光标记 199 辅助方案1 PMA 和lonomyC1n激活T细胞 200 辅助方案2 抗原活化T细胞 201 辅助方案3 固定和冻存PBMC 202 辅助方案4 PBMC 的细胞表面标记 202 辅助方案5 用荧光标记的抗细胞因子抗体标记活化细胞内的细胞因子 203 单元5.9 流式细胞仪检测细胞因子受体 204 基本方案 用抗受体单克隆抗体检测人和小鼠的细胞因子受体 204 备选方案1 用标记的细胞因子检测细胞因于受体 206 备选方案2 多参数分析检测淋巴细胞亚群细胞困于受体的表达 207 辅助方案1 单克隆抗体和细胞因子的滴定 208 辅助方案2 评价检测试剂 209 单元5.10 用流式细胞仪检测细胞因子的分泌和分离分泌细胞因子的细胞 210 基本方案 细胞因子分施实验 210 备选方案1 PBMC 分描细胞困于的快速检测 212 备选方案2 全血细胞分泌细胞因子的快速检测 213 单元5.11 ELISPOT方法检测分泌细胞困子的细胞 214 基本方案 214 单元5.12 a、R 和Y干扰素诱导的抗病毒活性的检测 218 基本方案 小鼠干扰素诱导的抗病毒活性的检测 218 辅助方案1 病毒培养体系的建立 220 辅助方案2 抗体中和实验 220 备选方案 人干扰素诱导的抗病毒活性的检测 221 单元5.13 趋化因子超家族的生物学反应 221 基本方案1 微型趋化实验检测趋化因子对粒细胞的趋化 221 备选方案1 微型趋化实验检测趋化因子对单核细胞的趋化 226 备选方案2 微型趋化实验检测趋化因子对淋巴细胞的趋化 227 辅助方案 细胞外基质蛋白包被聚碳酸醋膜 228 基本方案2 趋化因子诱导的淋巴细胞内游离钙离子的检测 228 第六章 天然免疫 231 单元6.1 小鼠巨噬细胞的分离 232 基本方案1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离 232 基本方案2 小鼠骨髓巨噬细胞的分离和培养 233 单元6.2 小鼠巨噬细胞的表型检测 234 基本方案 宜标法检测小鼠巨噬细胞的表型 235 备选方案 问标法检测小鼠巨噬细胞的表型" 236 单元6.3 人单核/巨噬细胞的表型检测 237 基本方案 237 单元6.4 小鼠巨噬细胞的活化 239 基本方案 小鼠巨噬细胞的活化 239 辅助方案 炎性小鼠巨噬细胞的活化 240 单元6.5 巨噬细胞一氧化氮的检测 241 基本方案 241 单元6.6 巨噬细胞吞噬功能和杀伤功能的检测 242 基本方案1 巨噬细胞吞噬功能的检测 243 辅助方案 利用FITC 区分胞外黠附和胞内吞噬的细菌 244 基本方案2 巨噬细胞杀伤功能的检测 244 辅助方案 单核细胞增多性利斯特氏菌的制备 245 单元6.7 巨噬细胞抗肿瘤活性的检测 246 基本方案 释放法检测巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用 246 辅助方案 标记肿瘤靶细胞 249 单元6.8 受体介导的秸附作用和吞噬作用的检测 251 基本方案 受体介导的吞噬作用 251 辅助方案 介导的雅附作用 253 单元6.9 干扰素介导的抗肿瘤作用 254 基本方案 254 单元6.10 人NKT细胞的分离和扩增 255 基本方案1 NK T细胞的鉴定 255 基本方案2 免疫磁珠法分离NKT细胞及后续扩增 256 备选方案1 NK T细胞的流式分选及扩增 258 备选方案2 NK T细胞的克隆 258 辅助方案 NKT细胞的二次剌激和克隆 259 第七章 抗原加工处理和呈递 261 单元7.1 抗原呈递细胞的选择和制备 261 基本方案 通过利斯特氏菌剌激制备腹腔巨噬细胞 262 备选方案1 连续注射利斯特民菌和脉蛋白陈后制备腹腔巨噬细胞 263 辅助方案1 小鼠腹腔注射用利斯特民菌的制备 263 备选方案2 ConA 剌激的腹腔巨噬细胞的制备 264 备选方案3 骨髓来源的巨噬细胞的制备 264 辅助方案2 制备L929 条件培养基 265 备选方案4 制备LPS 剌激的B 细胞 266 单元7.2 外源性抗原向T细胞的呈递 266 基本方案 一种抗原加工处理和呈递的检测体系 267 备选方案1 用固定后的贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肤 268 备选方案2 用固定后的非贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肤 269 备选方案3 蛋白抗原致敏的细胞固定后检测抗原加工和处理 269 第八章 人类免疫学研究 271 单元8.1 外周血和脐带血中分离单个核细胞 271 基本方案 Ficoll- Hypaque 梯度离心法分离单个核细胞 272 辅助方案 贴壁法去除单个核细胞中的单核细胞和巨噬细胞 272 单元8.2 T细胞亚群的分离纯化 273 基本方案 间接淘洗法分离T细胞亚群 273 备选方案 抗体依赖补体介导的细胞毒作用分离T细胞亚群 274 辅助方案1 应用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞 275 辅助方案2 应用AET处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞 276 单元8.3 免疫磁珠法纯化T细胞 276 基本方案 276 单元8.4 免疫磁珠法分离B 细胞亚群 278 基本方案 278 单元8.5 单核细胞/巨噬细胞的分离 280 基本方案1 贴壁法分离单核细胞 280 基本方案2 根据大小沉降作用分离单核细胞 280 基本方案3 对流离心洗淘法分离单核细胞 281 单元8.6 人自然杀伤细胞的分离 283 基本方案 从PBMC 分离人NK 细胞 284 辅助方案 阴性选择分离NK 细胞的单克隆抗体的滴寇 285 单元8.7 流式细胞仪检测全血的人淋巴细胞 286 基本方案 286 单元8.8 淋巴细胞增殖实验 288 基本方案 丝裂原诱导的外周血单个核细胞增殖实验 288 备选方案1 单向混合淋巴细胞反应 290 各选方案2 抗原诱导的T细胞增殖实验 292 辅助方案 掺入和细胞收集 292 单元8.9 B细胞分泌抗体的检测 293 基本方案 293 单元8.10 ELISA 检测抗体的含量 294 基本方案 294 单元8.11 ELISPOT检测抗体的含量 295 基本方案 ELISPOT检测分泌抗体的细胞 296 备选方案 用ELlSPOT检测仪检测分泌抗体的细胞 298 单元8.12 抗体的体内诱导和检测 299 基本方案1 蛋白质或多糖抗原体内法诱导抗体的产生 299 基本方案2 ELlSA 法检测体内抗体的产生 300 辅助方案 肺炎球菌多糖与蛋白质的偶联 301 单元8.13 T细胞杀伤功能的检测.302 基本方案1 抗CD3 诱导的T细胞杀伤实验 302 基本方案2 抗原诱导的特异性T细胞杀伤功能的检测 303 单元8.14 NK/LAK 细胞杀伤活性的检测 303 基本方案 51Cr 释放法检测NK/LAK 细胞杀伤活性 304 辅助方案 肿瘤靶细胞的制备和标记 306 单元8.15 人T细胞的克隆和扩增 307 基本方案l 抗原特异性T细胞的诱导 307 基本方案2 Th1 或Th2细胞的诱导 308 辅助方案1 T细胞的克隆 310 辅助方案2 克隆后T细胞的扩增 311 辅助方案3 T细胞克隆的冻存 312 单元8.16 制备EBV 转化的B 细胞 313 基本方案 313 单元8.17 分离人肠秸膜单个核细胞 314 基本方案 分离人肠藉膜单个核细胞 314 辅助方案 用尼龙毛过滤器去除死细胞 316 单元8.18 人树突细胞分离和培养 317 基本方案1 从外周单个核细胞中分离人树突细胞 317 备选方案 免疫磁珠法分离树突细胞 319 基本方案2 用单核细胞诱导人树突细胞 319 单元8.19 分离和鉴定人自然杀伤细胞亚群 321 基本方案 从PBMC 中分离人NK 细胞 321 辅助方案 人NK 细胞亚群的表型和功能分析 322 第九章 HIV 的检测与分析 326 单元9.1 外周血中HIV 的分离和定量检测 327 基本方案1 外周血中HIV 的培养以及通过TCID 定量来测定其滴度 327 基本方案2 感染同种异型T淋巴母细胞z 原代分离PBMC 中的HIV 329 辅助方案 评估HIV 对CD4+ 靶细胞的致细胞病变效应, HIV 介导的细胞死亡 329 单元9.2 感染CD4+ 原代细胞系及HIV 的诱导 330 基本方案1 用HIV 体外急性感染CD4+ 原代细胞及细胞系 330 基本方案2 建立HIV 慢性感染细胞系 332 基本方案3 慢性感染细胞系中HIV 的诱导" 333 单元9.3 在单核细胞和巨噬细胞中培养HIV 334 基本方案 单核细胞来源的巨噬细胞培养和HIV 感染 334 备选方案 用HIV 悬液感染单核细胞来源的巨噬细胞 336 辅助方案1 扩增实验室保存的亲巨噬细胞的HIV-l 病毒株 336 辅助方案2 扩增原代分离的亲巨噬细胞的HIV-l 病毒株 337 单元9.4 HIV 蛋白的检测 338 基本方案1 免疫印迹法检测HIV 蛋白 339 基本方案2 免疫荧光法检测HIV 蛋白 340 备选方案 流式细胞仪分析细胞内HIV 蛋白 342 基本方案3 HIV 反转录酶活性检测 343 单元9.5 用PCR 检测HIV 的DNA 及RNA 345 基本方案1 用PCR 扩增及检测HIV 的DNA 345 基本方案2 用RT-PCR 检测HIV 的RNA 349 单元9.6 体外评价各种制剂的抗HIV 活性 352 基本方案1 保护靶T细胞免受HIV 致细胞病变效应 352 基本方案2 表达CD4的HeLa 细胞合胞体斑形成抑制试验 353 基本方案3 ELISA 检测抗病毒剂对PBMC 中HIV p24 抗原产生的抑制作用 355 辅助方案 50%抑制浓度的计算 357 单元9.7 基于症苗病毒报道基因细胞融合检测法定量功能性测定HIV 包膜糖蛋白与受体的相互作用 358 基本方案用质粒表达包膜蛋白及受体进行融合检测 359 备选方案1 用重组病毒对各种成分的融合试验 361 备选方案2 活化的可溶性CD4融合检测 362 辅助方案1 比色法测寇融合-依赖的报道基因活性 362 辅助方案2 原位染色测定报道基因活性 363 第十章 自身免疫性及炎症性疾病动物模型" 365 单元10.1 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE) 366 基本方案 应用PLP 和MBP 蛋白或多肤主动诱导EAE 366 备选方案 MBP 或PLP 特异性淋巴细胞被动转移性诱导EAE 369 辅助方案1 PLP 蛋白的纯化 369 辅助方案2 MBP 蛋白的纯化 370 单元10.2 大鼠佐剂性关节炎 371 基本方案 佐剂性关节炎的诱导 371 辅助方案 分枝抨菌悬液的制备 373 单元10.3 胶原诱导性关节炎 373 基本方案 诱导小鼠胶原性关节炎 374 辅助方案1 II型胶原(CII)的纯化 375 辅助方案2 肢原(11) 1 链的纯化 376 辅助方案3 胶原(11) 1 链内漠化氟裂解片段的纯化 377 辅助方案4 小鼠关节炎的评定 380 辅助方案5 检测CIA 小鼠T细胞对CII 的增殖应答 381 单元10.4 小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎 382 基本方案1 实验性自身免疫性甲状腺炎的诱导和评定 382 辅助方案 小鼠甲状腺球蛋白的制备 384 基本方案2 诱导EAT耐受 385 单元10.5 小鼠实验性自身免疫性重症肌无力 386 基本方案 EAMG 的诱导和评定 386 辅助方案1 AChR 的抽提与亲和纯化 388 辅助方案2 神经毒素3 琼脂糖的制备 390 辅助方案3 应用肌电图评定EAMG 391 辅助方案4 通过检测抗AChR 抗体来评定EAMG 391 辅助方案5 小鼠肌肉AChR 的制备 393 单元10.6 NOD小鼠2-种膜岛素依赖性糖尿病模型 394 基本方案1 元特殊病原菌(SPF) 级NOD 小鼠的饲养 394 基本方案2 腕岛素依赖性糖尿病(IDDM) 的诊断 396 备选方案 半定量膜岛炎以作为进展为IDDM 的亚临床表现 396 辅助方案 膜腺中膜岛细胞的分离 398 单元10.7 通过耗竭调节性T细胞诱导自身免疫性疾病 400 基本方案 通过胸腺切除术诱导年轻的成年太鼠糖尿病 400 备选方案 应用胸腺切除术诱导3 周龄大鼠糖尿病 402 单元10.8 通过耗竭调节性T细胞诱导免疫缺陷小鼠炎症性肠道疾病 402 基本方案 转输T细胞诱导SCID小鼠IBD 402 辅助方案 监测IBD 进展 404 单元10.9 气道高反应性动物模型 406 基本方案 应用OVA 全身致敏及气道激发诱导气道超敏反应 406 辅助方案1 使用全身体积气压描记器非侵人性检测气道反应性 407 备选方案 OVA 致敏气道诱导气道超敏反应 408 辅助方案2 体外检测气道对电场剌激的反应性 409 辅助方案3 T细胞功能和气道炎症的评寇 410 单元10.10 诱导小鼠TNBS 结肠炎 411 基本方案小鼠TNBS 结局炎的诱导和评定 411 辅助方案1 分离小鼠肠系膜淋巴结细胞 412 辅助方案2 分离结肠炎小鼠的秸膜固有层细胞 413 单元10.11 系统性红斑狼疮动物模型 414 基本方案1 ELISA 检测小鼠血清中抗染色质抗体 415 基本方案2 单链和双链DNA 抗体的检测 416 基本方案3 ELISA 检测类风湿因子 417 基本方案4 ELISA 检测同种异型特异性抗体时标准曲线的制作 417 备选方案 ELISPOT检测抗染色质抗体形成细胞 420 辅助方案1 低渗裂解鸡红细胞核制备鸡染色质 421 辅助方案2 出DNA 的制备 421 辅助方案3 基于PCR 技术的fas肿突变体和fasL突变体的基因分型 422 第十一章 传染性疾病动物模型 425 单元11.1 问什曼原虫感染的小鼠模型 425 基本方案 皮肤利什曼原虫病小鼠模型 425 辅助方案1 使用花生凝集素制备后发育期前鞭毛体 427 辅助方案2 从足垫组织中纯化无鞭毛体 428 辅助方案3 前鞭毛体和无鞭毛体的冷藏和复苏 429 辅助方案4 血琼脂培养板的制备 430 单元11.2 弓形虫感染动物模型 430 基本方案1 诱导小鼠急性弓形虫T.gondii 感染 431 基本方案2 小鼠慢性弓形虫脑炎模型 431 基本方案3 感染T.gondii 的重症联合免疫缺陷小鼠 432 基本方案4 温度敏感的TS-4 T.gondii 菌株的感染模型 432 辅助方案1 对T.gondii 感染进展和免疫应答的评估 433 辅助方案2 ME49 T.gondii 包囊种子库的维持和保存 435 辅助方案3 用人类包庭成纤维细胞保存T.gondii速殖于 436 辅助方案4 小鼠体内保存T.gondii 速殖子 436 辅助方案5 T.gondii 裂解物抗原的准备 437 单元11.3 巨细胞病毒感染小鼠模型的建立 438 基本方案巨细胞病毒感染小鼠模型 438 辅助方案1 巨细胞病毒的准备 439 辅助方案2 唾液腺病毒的制备 440 辅助方案3 用空斑形成细胞试验测定巨细胞病毒滴皮 441 辅助方案4 原代小鼠胚胎成纤维细胞的制备 441 单元11.4 单核细胞增生性利斯特氏菌感染动物模型 442 基本方案 用单核细胞增生性1阿斯特氏菌株感染鼠 443 辅助方案1 小鼠感染利斯特氏菌后的特异性和固有免疫反应评估 444 辅助方案2 1阿斯特民菌特异性T细胞的制备 445 单元1 1.5 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染动物模型 447 基本方案1 全身性感染LCMV 小鼠模型 447 基本方案2 LCMV 病毒持续感染小鼠模型 449 基本方案3 T细胞对LCMV 免疫反应的测定 450 基本方案4 LCMV 疫苗效果的体内检测 451 辅助方案1 LCMV 病毒储存液的制备 452 辅助方案2 噬菌斑试验测定LCMV 病毒滴度 453 辅助方案3 ELISA 检测LCMV 抗体 454 单元11.6 流感病毒 454 基本方案1 流感病毒鼻腔内感染麻醉的小鼠 455 备选方案 流感病毒鼻腔内感染未麻醉小鼠 455 辅助方案1 流感病毒在鸡胚中扩增 455 辅助方案2 鸡胚尿囊液内流感病毒滴度的测定 457 辅助方案3 MDCK 细胞的长期培养 458 辅助方案4 培养组织流感病毒感染剂量。CID50) 的测寇 458 辅助方案5 小鼠50%致死剂量(MLD,,)和小鼠50%感染剂量(MID ) 459 辅助方案6 检测流感病毒滴度的小鼠肺脏制备 461 辅助方案7 流感病毒储存液中血凝单位的测定 462 辅助方案8 小鼠血清的血凝抑制试验(HAI) 463 辅助方案9 流感病毒储存液(原液)的系列稀释 464 基本方案2 从脾脏前体细胞获得流感病毒特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTL) 464 基本方案3 收集含抗流感病毒CTL 的肺脏细胞 465 辅助方案10 流感病毒中和试验 466 第十二章 蛋白质分离和分析 468 单元12.1 免疫亲和层析 468 基本方案 可溶性或膜结舍抗原的分离 468 备选方案1 抗原低pH 洗脱 471 备选方案2 用辛烧基[t-D-葡糖背洗脱抗原 471 单元12.2 免疫沉淀 472 基本方案1 用非变性去垢剂裂解细胞制成的悬液进行免疫沉淀 472 备选方案1 用含非变性去垢剂洛液裂解的贴壁细胞进行免疫沉淀 476 备选方案2 用含变性去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀 476 备选方案3 用元去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀 476 备选方案4 用抗体-Sepharose 进行免疫沉淀 477 辅助方案 抗体Sepharose 的制备 479 备选方案5 用与ANTI-lg 结合的放射性标记的抗原进行免疫沉淀 480 基本方案2 再次捕获免疫沉淀 480 单元12.3 单向蛋白质凝胶电泳 483 基本方案 483 单元12.4 凝胶蛋白质染色 486 基本方案1 考马斯亮蓝染色 486 基本方案2 银染 486 基本方案3 SYPRO Orange 或SYPRO Red 荧光染色 487 基本方案4 SYPRO Ruby 荧光染色 488 备选方案1 聚丙烯眈胶凝胶上磷蛋白的特异性荧光染色 489 辅助方案 磷酸酶氨酸残基的特异性检测 490 备选方案2 同一块凝胶上的糖基化蛋白和非糖基化蛋白的差异性荧光染色 491 单元12.5 免疫印迹和免疫检测 492 基本方案1 液体容器中的蛋白质印迹 492 备选方案1 半干胶系统蛋白质印迹 494 辅助方案1 转移蛋白的可逆染色 495 基本方案2 采用工抗检测的免疫探针法 495 备选方案2 亲和素生物素化二抗的免疫探针法 496 基本方案3 生色底物显色 497 备选方案3 生包底物显色 498 辅助方案2 膜蛋白解离与再生 499 第十三章 肽 500 单元13.1 合成肤用以制备识别完整蛋白质的抗体 500 基本方案1 通过计算机辅助方法选择合适的抗原肤序列 500 备选方案1 通过人工筛查挑选合适的肤序列 501 基本方案2 设计一条肤链与载体蛋白相偶联 502 备选方案2 设计合成一条多价抗原肤 503 基本方案3 使用双功能团试剂将合成肤偶联至载体蛋白 504 备选方案3 使用双功能回试剂将舍成肤偶联至载体蛋白 505 辅助方案 计算肤连接到载体蛋白上的摩尔率 505 单元13.2 抗多肤血清的制备 507 基本方案1 在兔体内制备抗多肤血清的免疫接种流程 507 基本方案2 用间接ELlSA 法检测抗多肤抗体滴度 507 基本方案3 使用酸性、碱性或离液洗脱液的亲和层析柱 508 辅助方案1 预先榕胀的NHS 或CNBr 活化树脂的肤免疫亲和层析柱的制备 509 辅助方案2 疏基化椅脂填充的肤亲和层析柱的制备 511 单元13.3 采用合成肤组合库鉴定B 细胞和T细胞的表位 512 基本方案1 采用PS-SCL 筛选抗体抑制剂 512 基本方案2 筛查PS-SCL 鉴定CD4+ 或CD8+ T细胞的配体 514 辅助方案 优化用于筛查的抗原和抗体浓度 515 第十四章 分子生物学 518 单元14.1 293T细胞包装和扩增反转录病毒 519 基本方案1 磷酸钙/DNA 沉淀瞬时转染Phoen皿反转录包装细胞 519 备选方案1 水痕性口炎病毒G 蛋白的假型反转录病毒 521 辅助方案1 水殖性口炎病毒G 蛋白假型反转录病毒的浓缩和低温储存 521 辅助方案2 Phoenix 细胞的培养 522 基本方案2 感染贴壁细胞 523 备选方案2 贴壁细胞快速(spin) 感染见基本方案 523 备选方案3 悬浮细胞的快速(spin) 感染 524 单元14.2 免疫球蛋白融合蛋白的构建 524 基本方案1 免疫球蛋白融合蛋白的梅建 524 基本方案2 免疫球蛋白融合基因分析 526 单元14.3 单链抗体的噬菌体展示技术 529 基本方案1 全套单链抗体噬菌体载体的构建 532 基本方案2 scFv 展示噬菌体在抗原包被板上的亲和筛选 537 备选方案 链霉亲和素包被的磁珠富集筛选生物素化抗原结舍的scFv 展示噬菌体 540 基本方案3 ELISA 鉴定抗原结合的scFv 展示噬菌体 541 辅助方案1 辅助噬菌体冻存液的配制 543 辅助方案2 指纹图谱和PCR 检测克隆的正确性和多样性 544 辅助方案3 蛋白质的生物素化(NHS-SS-生物素) 545 辅助方案4 利用生物素-蛋白连接酶使蛋白生物素化 545 单元14.4 整体培养中同型转换重排的PCR 检测 546 基本方案1 通过转换接头的直接PCR 546 辅助方案 通过PCR 和随机引物标记法制备5'部探针 550 基本方案2 消化环化PCR 550 单元14.5 PCR 检测细胞因子mRNA 的表达 553 基本方案 寇量IL-2 mRNA 表达水平 553 单元14.6 PCR 检测人T细胞受体基因的表达 556 基本方案PCR 检测人T细胞受体基因的表达 556 备选方案PCR 定量检测TCR 可变序列转录产物 559 辅助方案1 重排V-D-J 区测序 560 辅助方案2 cDNA 合成 562 单元14.7 PCR 检测小鼠T细胞受体表达 563 基本方案1 PCR 分析小鼠TCR 基因表达 563 基本方案2 PCR 检测小鼠TCR 可变区的频率 567 基本方案3 对小鼠可变区转录物进行PCR 定量 567 基本方案4 序列分析V (D) J 区的接头多样性 570 辅助方案 DNA 舍成用于小鼠TCR 基因表达的PCR 分析 571 单元14.8 TCR 库的抗原谱/免疫扫描技术分析 572 基本方案1 人和小鼠TCR 受体库多样性的免疫扫描技术分析 574 备选方案利用["町dCTP 进行免疫扫描分析 580 基本方案2 链接区引物进行高特异的分光光度分析 581 基本方案3 TCR 基因扩增产物的快速高通量测序 582 单元14.9 多探针核糖核酸酶保护试验同时测定mRNA 表达.586 基本方案 多探针核糖核酸酶保护试验 586 辅助方案1 构建一个核糖探针模板 590 辅助方案2 凝胶电泳和结果的可视化 592 单元14.10 端粒长度和端粒酶活性的分析 593 基本方案1 Sou杂交检测传统凝胶电泳中末端端粒DNA 限制性片段(TRF)的端粒长度 593 备选方案1 尼龙膜上的Southem 杂交 594 辅助方案1 端粒或其他寡聚核苦酸末端标记 595 基本方案2 用脉冲电场凝胶电泳法测量端粒 595 基本方案3 荧光原位杂交 597 基本方案4 QFISH 599 辅助方案2 从分裂的淋巴细胞中制备分裂中期染色体 601 基本方案5 端粒酶活性的测定 601 备选方案2 非放射性的TRAP 分析方法1荧光染料(SYBR 1)标记 604 备选方案3 非放射性的TRAP 分析方法2荧光染料(TAMRA-TS) 标记 604 第十五章 免疫分子与受体工程学 606 单元15.1 用MHC-Ig 二聚体检测抗原特异性T细胞 607 基本方案 构建MHC I-Ig 二聚体 607 辅助方案1 测定MHC-jg 融合蛋白浓度 610 辅助方案2 转染细胞大规模培养及上清的浓缩 611 辅助方案3 用5-4-握基-3-硝基酷乙酷-琼脂糖凝胶层析法纯化MHC-Ig二聚体 612 辅助方案4 制备5-棋-4-费基-3-硝基酣乙酷-琼脂糖凝胶 613 辅助方案5 通过被动交换法为MHC-Ig嵌合蛋白负载多肤 614 辅助方案6 碱洗脱法负载多肤 614 辅助方案7 温和酸性条件下负载多肤 615 辅助方案8 流式细胞分析抗原特异性T细胞 615 单元15.2 用MHC 肤四聚体显现抗原特异性T细胞 616 基本方案1 制备带BirA 底物标签的MHCI 类分子亚单位体 619 基本方案2 MHC 1 类分子肤复合物的重新折叠 622 辅助方案1 用ELISA 测寇MHC 623 辅助方案2 用分子大小排阻层析法进行超滤和纯化以浓缩折叠蛋白 624 基本方案3 用酶进行生物素化、纯化及生物素化效率的分析 625 基本方案4 用链亲和素使生物素化的单体形成多聚体 628 基本方案5 用标记的MHCI 类分子四聚体通过流式细胞分析含特异性T细胞受体的细胞 629 附录1 试剂与溶液 631 附录2 实验用小鼠、大鼠和仓鼠 701 附录2A 常用小鼠和大鼠品系 701 附录2B 饲养 704 附录2C 处理和捕捉 706 基本方案1 小鼠的处理和捕捉 707 基本方案2 大鼠的处理和捕捉 707 基本方案3 仓鼠的处理和捕捉 708 备选方案 啮齿类动物捕捉器 708 附录2D 麻醉 709 基本方案1 小鼠、大鼠和仓鼠的注射麻醉 710 基本方案2 用甲氧氟烧吸入法麻醉小鼠、大鼠和仓鼠 711 附录2E 腹腔注射 712 基本方案1 小鼠、大鼠和仓鼠的肌肉注射 712 基本方案2 小鼠、大鼠和仓鼠的皮内注射 713 基本方案3 小鼠、大鼠和仓鼠的皮下注射 713 基本方案4 小鼠的静脉注射 714 基本方案5 小鼠、大鼠和仓鼠的腹膜内注射 715 基本方案6 小鼠足垫注射 715 基本方案7 小鼠胸腺内注射 715 附录2F 血液收集 716 基本方案1 小鼠和大鼠的眼眶或眼血管丛取血 717 基本方案2 小鼠和太鼠的尾静脉微量采血管取血 717 备选方案 从小鼠和大鼠的尾静脉以离心管取血 718 基本方案3 小鼠腋窝丛取血 718 附录2G 安乐死 719 基本方案1 二氧化碳窒息 719 基本方案2 过量戊巴比妥注射 719 备选方案1 麻醉下放血 720 备选方案2 小鼠颈椎脱臼 720 附录2H 淋巴器官和胸腺的摘除 720 基本方案1 小鼠淋巴器官的摘除 720 基本方案2 脾切除术 722 备选方案 脾半切除术 723 基本方案3 新生鼠胸腺摘除 724 基本方案4 成年鼠的胸腺摘除术 725 辅助方案 胸腺吸人套管的制备 727 附录3 免疫学常用细胞实验技术 729 附录3A 细胞生长的检测 729 基本方案1 血细胞计数板计数细胞 729 基本方案2 库尔特粒度仪计数细胞 729 附录3B 细胞冻存 730 基本方案1 细胞株或杂交瘤的冻存 730 基本方案2 细胞株或杂交瘤细胞的复苏 730 附录3C 台盼蓝拒染试验检测细胞活力 731 基本方案 731 附录3D 瑞民一吉姆萨和非特异性醋酶染色 732 基本方案1 瑞氏吉姆萨染色通常用于淋巴细胞形态的研究 732 基本方案2 非特异性醋酶染色 733 附录3E H TdR的掺入 733 基本方案 733 附录3F 判断并处理细胞培养中的支原体污染 734 基本方案1 检测可能存在的支原体污染 734 基本方案2 用BM-cyc1in 处理污染的细胞 735 备选方案 用环丙沙星处理支原体污染的细胞 736 附录3G 人外周血单个核细胞的分离 736 基本方案 静脉穿刺采集外周血 736 备选方案 淋巴细胞去除法取血 737 附录4 试剂和设备的供应商 738 参考文献 785 索引 797
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